Zentrum der Dauerausstellung zur mittelalterlichen Kunst in Rostock ist der um 1440 entstandene ehemalige Hochaltar der St. Johanniskirche. Der Wandelaltar war mit zwei Flügelpaaren ausgestattet, von denen jedoch nur eines erhalten geblieben ist.
Die Kreuzigung aus dem Schrein und die Heiligenfiguren von den Flügelinnenseiten weisen durch ihre porträtähnlichen Züge auf ihre Herkunft aus Rostock hin. Weitere Heiligenfiguren, vermutlich aus dem gleichen Altar, deuten auf einen weiteren beteiligten Künstler hin. Ein Marienaltar aus St. Johannis zeigt eine Madonna im Strahlenkranz (um 1450). Ebenfalls aus St. Johannis stammt ein Kruzifix von einer Triumphkreuzgruppe aus dem 13. Jahrhundert (um 1270): eines der ältesten Norddeutschlands. Aus der Hospitalkirche zum Heiligen Geist stammt ein Gnadenstuhl aus der Mitte des 15. Jahrhunderts.
Gestühlswangen aus St. Nikolai weisen durch ihre porträthafte realistische Gestaltung und die ausgeprägte Körper-Gewand-Beziehung auf das späte 15. beziehungsweise frühe 16. Jahrhundert. Die reiche Kollektion mittelalterlicher Kunstwerke aus der Sammlung des Kulturhistorischen Museums Rostock wird durch Stücke aus dem Schatz des Klosters zum Heiligen Kreuz ergänzt.
